Прощай, плоская биология

Типовая новость любого научно-популярного концентратора выглядит так – «Британские ученые открыли молекулу против какого-нибудь недуга». Дальше следует многообещающий вывод.

Увы, реальность, как всегда сильно прозаичнее. Таких «открытий» ежегодно в мире происходят тысячи, но лишь единицы доходят до аптеки, и именно на них зарабатывают сотни миллионов долларов. Остальные молекулы летят в корзину.

95% лекарств, показавших свою эффективность в пробирках, проваливаются на дальнейших этапах исследований. Почему так?

Я начал обсуждать этот вопрос в статье про электроспиннинг. Причина проста: всякий эксперимент – это упрощенная модель. Вместо настоящих человеческих тканей и органов для исследования эффективности препарата используется монослой клеток определенной линии.

Монослой – это один ряд клеток, прикрепленных одной своей стороной к пластику, а второй обращенных к питательной среде, в которую может быть добавлен испытуемый препарат.

монослой

Такая модель совершенно не похожа на условия, в которых лекарство будет действовать в организме человека. В статье «клеткин дом» я рассказывал, что наши ткани – это сложные трехмерные конструкции, обладающие определенными физическими параметрами, например, плотностью и эластичностью. Клетки существуют в них в тесном взаимодействии друг с другом и со стромой, состоящей из внеклеточного матрикса, сосудов и нервов.

Ткань – это неоднородная среда: где-то больше кислорода и питательных веществ (например, рядом с кровеносными сосудами) где-то меньше, где-то выше давление межклеточной жидкости, где-то ниже. Соответственно есть зоны, где клеточная пролиферация активна, а есть – где клеточный цикл замер. Все эти условия определяют форму клетки, активность ее генетического аппарата и функционирование. А значит, и эффект, который лекарство может произвести на одни и те же клетки, находящиеся в разных условиях, будет разным.

В чашке Петри полное «благорастворение» – все клетки находятся в одинаковых условиях и одинаково доступны для лекарства, добавляемого в питательную среду. Слово благорастворение я взял в кавычки, потому что условия монослоя для клетки абсолютно ненормальны. Когда клетку вырывают из привычной ей трехмерной среды и вносят в двухмерный монослой – она меняет все свои характеристики.

полярность клеток в трехмерной среде

Клетка уплощается, прижимается к пластику и приобретает базально-апикальную полярность. Она перенастраивает свой цитосклелет, расположение органелл и экспрессию молекул адгезии на мембране таким образом, чтобы надежно прикрепиться к единственной доступной поверхности – дну чашки для культивирования. Это сильно отличается от условий в обычной ткани, где клетка имеет возможность контактировать со своим микроокружением всеми поверхностями сразу.

Эти контакты регулируют такие важные функции клетки, как:

  • Выживание
  • Дифференциацию
  • Пролиферацию и
  • Способность к передвижению (смотри «калланетика для лейкоцита)

Монослой решительно меняет все эти настройки, а, ведь, именно способность клетки сопротивляться апоптозу (выживание) и пролиферировать – главные мишени многих лекарственных препаратов, преимущественно противоопухолевого ряда.

Условия двухмерного и трехмерного культивирования столь различны, что они определяют и групповое поведение клеток. Вот, сравните, например, одни и те же клетки, находящиеся в разных условиях.

рост клеток в трехмерной среде

В монослое (2D) они хаотично расположены по поверхности. В трехмерной модели они собираются вместе в определенные конструкции, напоминающие настоящую высокодифференцированную ткань, из которой они и были получены (справа).

Все это заставляет исследователей искать новые, трехмерные, модели для изучения эффективности лекарственных препаратов. Одной из важных задач тремехрного моделирования является воспроизведение барьеров на пути лекарства.

Как правило, к своей клетке-мишени, например, эпителиальной, лекарство попадает из крови, «пробираясь» сквозь строму ткани – межклеточный матрикс и стромальные клетки. При этом – чем дальше клетка-мишень находится от сосуда и чем выше плотность стромы – тем сложнее лекарству добраться до места назначения.

Это особенно важно для противоопухолевых препаратов, которым нужно проникать сквозь плотную ткань, инфильтрированную большим количеством клеток. На этом графике показано – как падает концентрация доксорубицина в ткани по мере удаления от ближайшего кровеносного сосуда.

распределение лекарства в плотной ткани

Понятно, что на ближние и удаленные клетки препарат подействует по-разному. И не только из-за разной концентрации, но и из-за того, что, удаленные клетки находятся в зоне гипоксии, а в таких условиях клеточный цикл замирает, а доксорубицин действует только на активно делящиеся клетки. В результате, эффективность лекарства ограничена с самого начала. Монослой никогда не моделирует таких условий – там доступность клеток для препарата всегда одинаковая.

Самой простой трехмерной моделью барьера на пути лекарства является эпидермальная модель.

эпидермальная модель

Эта конструкция очень похожа на обычный монослой с той разницей, что изучаемые клетки (кератиноциты эпидермиса) не адгезируются к пластику, а покоятся на каркасе, выполненным из коллагена и стромальных клеток (преимущественно, фибробластов).

Коллагеновый каркас расположен в пластиковой чашке с фильтрующим дном, погруженной в питательную среду. В результате, обеспечение эпителиальных клеток ростовыми и регулирующими факторами, а заодно и лекарствами, происходит через каркас стромальных клеток и базальную мембрану самих эпителиальных клеток.

эпидермальная модель

Эта модель может быть использована для культивирования клеток-мишеней и скринирования лекарственных препаратов.

эпидермальная модель

На этой картинке – микроскопия меланоцитов и клеток меланомы разных фаз роста на эпидермальной модели. FOM – обычные меланоциты, RGP – рост клеток меланомы в пределах базальной мембраны, VGP – рост клеток за пределы базальной мембраны (инвазия), MET – глубокая инвазия. Таким образом, клетки меланомы в этой модели ведут себя так же, как и в настоящей ткани. Смоделировать такое в монослое невозможно.

Более сложной трехмерной моделью стали сфероиды – искусственные трехмерные микроструктуры, самособирающиеся из клеток. Диаметр сфероида варьирует от 20 до 1,000 мкм.

клеточный сфероид

Сборка сфероида достигается тем, что клетки помещаются в специальные сферические лунки, сделанные из анти-адгезионного материала, так что клетки не могут прикрепиться ко дну и стенкам. Вместе с клетками в лунку помещаются элементы внеклеточного матрикса.

сборка сфероида

В этих условиях клетки начинают приклепляться друг к другу. При этом, в отличие от монослоя, в прикреплении участвует не одна, а все стороны клетки. Через некоторое время инкубации формируется cферический агломерат клеток и элементов внеклеточного матрикса, не адгезированные к пластику.

Впервые эта модель появилась еще в 70е годы 20 века. Вот один из первых опубликованных снимков сфероида.

первая фотография сфероида

Главное преимущество сфероида, по сравнению с монослоем, в том, что он моделирует гетерогенную сущность трехмерной ткани, воспроизводя зоны с разным доступом к кислороду, питательным и ростовым факторам.

зоны сфероида

Внешняя зона сфероида, контактирующая с питательной средой, наиболее благоприятна для пролиферации клеток. В следующей зоне начинается гипоксия и дефицит питательных веществ. Клеточный цикл в этой зоне замирает, но сами клетки живы. В центре сфероида, где максимальное голодание, находится зона некроза.

Такое зонирование сфероида легко визуализируется специальными маркерами –

пролиферация и апоптоз в сфероидах

Ki-67, маркер пролиферации, показывает, что клеточное деление (темные точки) происходит на периферии, а TUNEL (апоптоз) визуализирует погибшие клетки (зеленые точки) в центре сфероида.

Гипоксическая среда в средней зоне и центре сфероида визуализируется и биохимическими методами, например, по эффекту Варбурга. Обычно энергия в клетке накапливается за счет окислительного фосфорилирования, но в условиях гипоксии происходит переключение на анаэробный гликолиз, продуктом которого является лактат.

эффект Варбурга

Эксперименты на сфероидах показывают, что по мере роста их диаметра количество лактата нарастает, а значит увеличивается зона гипоксии. В этой зоне препараты конвенциональной химиотерапии не эффективны. В монослое такого эффекта нет.

Сфероиды – не единственная трехмерная конструкция, предлагаемая для более корректного изучения эффективности новых лекарственных препаратов. Про другие модели мы поговорим в следующих постах, но у все у них пока что есть один существенный недостаток – сложность в стандартизации метода.

Трудно добиться, чтобы во всем мире использовались абсолютно стандартные сфероиды, так как их рост и геометрию трудно контролировать. Но движение в сторону трехмерного моделирования биологических процессов уже сделано, и, рано или поздно, появятся полноценные скриннинговые модели, которые резко изменят условия игры в индустрии drug development.

Добавить комментарий

Такой e-mail уже зарегистрирован. Воспользуйтесь формой входа или введите другой.

Вы ввели некорректные логин или пароль

Извините, для комментирования необходимо войти.