Реконструкция потока

В предыдущих постах мы поговорили о том, что форма, поведение и судьба клетки зависят не только от нее самой, но и от внешних факторов:

  • Контакта с другими клетками и внеклеточным матриксом
  • Физических условий ткани – cдавления, растяжения, градиентов концентраций
  • Растворимых факторов (цитокинов, факторов роста и других молекул)

Однако, до сих пор я не упомянул еще один момент. Каждая ткань организма снабжается кровью. Как это учесть при моделировании? Мы привыкли думать, что кровь – это просто средство доставки кислорода, питательных и регулирующих веществ и иммунных клеток, а заодно удаление метаболитов.

Но мы забыли про физику крови. Кровь – это ткань, причем очень упругая. Когда компоненты крови (и плазма и клетки) двигаются по сосуду или сквозь ткань (перфузия), возникает особый вид механического взаимодействия – shear stress.

гемодинамический стресс

Этот феномен переводят по-разному, но суть – биологические реакции клеток в ответ на механическое «трение», которое производят компоненты крови (межтканевой жидкости, лимфы) о клетки.

Клетки способны чувствовать это трение (назовем его «гидродинамический стресс») благодаря сразу нескольким механизмам передачи механического сигнала –

механизм гемодинамического стресс

Например, на мембране клеток есть ионные каналы, которые активируются в ответ на растяжение, что всегда имеет место при гидродинамическом воздействии. Отдельные реснички на мембране могут ощущать движение потока и передавать сигнал о нем внутрь клетки. Контакты между соседними клетками, а также клетками и матриксом, реализованные через адгезионные молекулы, связанные с молекулами цитоскелета, также могут реагировать на растяжение.

Эти и другие механизмы, запускаемые в клетке в ответ на гидродинамическое воздействие, стимулируют важные процессы внутри ядра, отвечающие за:

  • Экспрессию генов
  • Синтез молекул
  • Морфологию клетки и
  • Метаболизм

Обратите внимание на то, как клетки эндотелия выстраиваются по вектору гидродинамического стресса в специальной вращающейся чашке.

гидродинамический стресс

Но этим примечательным парадом дело не ограничивается. В ответ на гидродинамический стресс эндотелиоциты повышают выработку важного ростового фактора для самих себя – Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Эта молекула управляет ростом новых сосудов, а заодно повышает способность эндотелиоцитов сопротивляться апоптозу, то есть помогает выживать.

влияние гидродинамического стресса на рост клеток

Слева в статичной среде эндотелиальные клетки разобщены. Справа, в активном потоке, они сливаются и разворачиваются параллельно действующим гидродинамическим силам, начиная формировать новый сосуд.

экспрессия VEGF в гидродинамическом стрессе

Слева достоверное увеличения уровня экспрессии VEGF у «крутящихся» клеток, а справа достоверное снижение уровня апоптоза у них же. Движение – жизнь, граждане.

Гидродинамический стресс регулирует работу клеток не только в кровеносных сосудах, но и в ткани, сквозь которую происходит перфузия крови. Вот так, например, он действует на мезенхимальные стволовые клетки (МСК).

гидродинамический стресс регулирует работу клеток

В эксперименте сравнили МСК, культивируемые в статичных условиях (верхний ряд), с клетками, подвергшимися гидродинамическому стрессу (нижний ряд).

Стволовые клетки, оказавшиеся в динамичной среде, начали размножаться и превращаться в эндотелиоциты, что видно по росту экспрессии фактора vWF – специфического маркера эндотелиальных клеток, а также перестройки цитоскелета клеток (phalloidin) и их пролиферации (nuclear stain). Правая колонка – наложение всех трех изображений.

Мы уже обсуждали роль механических воздействий на клетку в регуляции ее важнейших элементов жизнедеятельности. Физические условия, в которых находятся клетки, а также пространственная геометрия их «жилища» определяют их фенотип и функционирование.

Поэтому для моделирования более естественных условий стали применять трехмерные конструкции ткани — сфероиды, пористые каркасы и микроволокнистый матрикс. Однако, все эти модели упускают один важный неотъемлемый элемент живого организма – перфузию.

Если питательная среда, в которой культивируются эти конструкции, неподвижна, то исследователи выключают из эксперимента важнейшие физиологические составляющие:

  • Градиент давления
  • Постоянный приток кислорода, питательных и регулирующих факторов
  • Одновременное удаление продуктов жизнедеятельности клеток
  • Гидродинамический стресс
  • Миграцию клеток из кровеносного русла в ткань

Поэтому самые прогрессивные методы объемного конструирования тканей включают перфузионный компонент.

Как это выглядит?

Относительно простой пример – это расположение трехмерного каркаса, населенного клетками, в капсуле, через которую осуществляется постоянный ток питательной среды.

перфузионный реактор

В фабричном исполнении это может выглядеть вот так –

биореактор

В этом примере при помощи модификации метода электроспиннинга создаются полимерные многослойные «столбики» из микроволокна, на которые вы сеете интересующие вас клетки. Полученную конструкцию закрепляют в специальных камерах, через которые постоянно прокачивается питательная среда.

Другой метод позволяет воссоздать события, происходящие в кровеносном сосуде, при помощи биопринтера –

биопринтер

Сначала в специально подготовленной камере печатается 3-4 слоя коллагена. Затем сверху вы добавляете один слой смеси жидкого желатина и тех клеток, которые вы хотите культивировать. В этом эксперименте – эндотелиоциты из пупочной вены.

Затем смесь желатина и клеток солидифицируют, и сверху допечатывают коллаген, пока не заполнится камера. На печать всей конструкции уходит около 40 минут. После этого конструкцию необходимо проинкубировать в течение часа при температуре 37С, что желатин стал жидким. Эндотелиальные клетки в желатине приходят в движение, и во время инкубации необходимо постоянно вращать всю конструкцию продольно оси расположения клеток – так, чтобы они все равномерно осели на коллагеновых стенках желатинового канала.

После окончания адгезии клеток к стенкам канала – конструкция подключается к специальной помпе, которая аккуратно подает в канал питательную среду, вымывающую из него жидкий желатин. И вот – у вас работающая модель кровеносного сосуда, на которой вы можете изучать физиологию эндотелиальных клеток и воздействовать на них интересующими вас молекулами.

Но нам нужно больше – мы хотим получить модель кровоснабжаемой ткани, например, ткани легкого. Наиболее современный способ решить эту задачу называется organonachip.

орган в чипе

На специальных прозрачных полимерах формата компьютерного чипа создаются камеры для размещения искусственного матрикса, населенного изучаемыми клетками. Эти камеры сообщаются с каналами для тока питательной среды и для воздуха (в случае lung-on-chip). Движение жидкости и воздуха осуществляется подключенными к чипу помпами.

Вот так выглядит чип легкого –

чип легкого

Верхняя часть канала заселена эпителиальными клетками легких. В канале над ними проходит воздух. Под эпителиоцитами располагается пористая мембрана, а под ней слой эндотелиальных клеток кровеносного сосуда, по которому течет питательная среда. По бокам главного канала находятся два вспомогательных, которые при помощи изменения давления имитируют дыхание, ритмично растягивая оба клеточных слоя в стороны.

С такой моделью вы можете испытывать воздействие лекарств на оба типа клеток или имитировать патологические состояния – например, заразить эпителий бактериями, а по капиллярному каналу запустить иммунные клетки и наблюдать их миграцию сквозь два слоя клеток.

Из таких чипов можно теоретически собрать модель человеческого тела.

человек в чипе

В любом случае, этот метод максимально приблизил нас к корректной модели человеческой ткани, которую можно стандартизовать для скрининга эффективности потенциальных лекарственных препаратов и более глубокого изучения патогенеза заболеваний.

Добавить комментарий

Такой e-mail уже зарегистрирован. Воспользуйтесь формой входа или введите другой.

Вы ввели некорректные логин или пароль

Извините, для комментирования необходимо войти.